Le traitement secondaire élimine la matière organique soluble, les nutriments tels que l'azote et le phosphore, et la plupart des solides en suspension qui échappent au traitement primaire. Le plus souvent, sont utilisés des procédés biologiques dans lesquels les microbes métabolisent les composés organiques et les nutriments pour croître et se reproduire. Les deux procédés de traitement secondaire biologique les plus courants sont les systèmes de croissance fixée et les systèmes de croissance en suspension. Un procédé de croissance en suspension favorise la croissance de flocs et de micro-organismes en suspension provenant d'organismes individuels déjà présents dans les eaux usées et dans les boues activées de retour. Les flocs contiennent des organismes qui peuvent éliminer les polluants dans des milieux aérobies, anoxiques et anaérobies. Une fois les polluants éliminés, les flocs sont envoyés dans un procédé de clarification secondaire où ils se séparent de l'eau par gravité. Une partie des boues dans le fond du clarificateur secondaire est ensuite renvoyée en amont pour être mélangée à l'effluent primaire (boues activées de retour) afin de créer une liqueur mixte. Le reste des boues est retiré du procédé (boues activées) pour créer l'écologie idéale des micro-organismes. Les systèmes de croissance fixée s'appuient sur le fait que les micro-organismes se fixent à un milieu et créent un biofilm. Les eaux usées décantées sont soit mélangées, soit saupoudrées sur le support revêtu d'un biofilm sur lequel les micro-organismes éliminent les polluants. Tout comme le procédé de croissance en suspension, les fragments de biofilm et les flocs en suspension sont envoyés dans un clarificateur secondaire pour séparation où les boues sont recyclées et déchargées tandis que l'eau propre est rejetée.
Pour que le traitement biologique fonctionne efficacement, les organismes ont besoin d'éléments nutritifs dans un rapport équilibré, dont le carbone, l'azote et le phosphore (appelés C:N:P), ainsi que d'oligo-éléments comme le fer, le cuivre, le zinc, le nickel, le manganèse, le potassium, le soufre et d’autres composants qui se trouvent généralement dans les eaux usées. Le rapport C:N:P communément accepté est de 100:5:1. Bien que certaines installations prospèrent en dehors de ce rapport, d'autres connaissent une formation de boue polysaccharidique ou une croissance bactérienne filamenteuse qui nuisent à la biologie et à la sédimentation dans le clarificateur secondaire.
Plusieurs procédés biologiques peuvent être utilisés pour compléter le traitement secondaire, y compris les bassins d'aération à écoulement piston, les bassins d'aération homogènes, les réacteurs biologiques séquentiels, les chenaux d'oxydation, les filtres à ruissellement, les réacteurs biologiques à lit mobile, les boues activées à film fixe intégré, et autres.
L'élimination biologique des nutriments (EBN) modifie l'environnement des micro-organismes pour éliminer l'azote et le phosphore de l'eau. Un procédé EBN se compose d'étapes anaérobies (pas d'oxygène, pas de nitrate), anoxiques (nitrate présent, pas d’oxygène), et aérobies (oxygène présent), au cours desquelles l'eau est passée à travers une série de chambres pour exécuter diverses fonctions biologiques.
Des procédés de traitement chimique peuvent également être utilisés, comme l'élimination chimique du phosphore. En introduisant un précipitant chimique dans le bassin d'aération et dans les clarificateurs, le phosphore est éliminé par floculation. Il se lie en composés insolubles qui se déposent et peuvent être éliminés en tant que boues.